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2-AB多糖標記試劑盒

貨號:L-KAB-A2
包裝:Kit
  • 英文名:2-AB glycan labeling kits
  • 品牌:ludger
LudgerTag? 2-氨基苯甲酰胺多糖標記試劑盒,貨號:LT-2AB-A2,包含經胺化還原反應使染料結合在多糖未結合還原端基的試劑,用于標記未結合多糖。

*西寶提示:我司所銷售的化學試劑、原料等所有產品(包括但不限于抗生素類、蛋白質類、試劑盒類產品等)僅限用于科學研究用途,不得作用于人體。

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LudgerTag™ 2-AB(2-氨基苯甲酰胺)多糖標記試劑盒(貨號:LT-KAB-A2)包含經胺化還原反應使染料結合在多糖未結合還原端基的試劑,使用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)標記未結合多糖。
應用:用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)標記未結合多糖
染料性質
分子量 136.15
熒光 λex(染料) = 320 nm, λem = 420 nm
結構
2-AB (2-Aminobenzamide)
樣品數:通常每套標記試劑最多可分析15個獨立樣品。
樣品量:每個樣品含25pmol到25nmol多糖。
適合檢測的樣品:任何帶有未結合還原末端的純化聚糖,都可以進行標記。
結構完整性:未發現唾液酸、巖藻糖、硫酸鹽或磷酸鹽的損失(<2摩爾百分比)。
標記效率:通常大于85%(取決于樣品)。
標記選擇性:本質上是化學計量標記。
儲存:室溫下暗處儲存。遠離熱源、避光和防潮。所供試劑至少可穩定保存兩年。
運輸:該產品可在室溫下運輸。
處置:使用時涉及的任何玻璃或塑料器皿以及溶劑,應確保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有樣品處理時,使用無粉末手套,避免受到外源性碳水化合物的污染。標記試劑設計的所有步驟都必須在干燥環境下操作,并使用干燥的玻璃和塑料器皿。一旦打開試劑瓶,應立即使用。多余試劑根據當地安全規則丟棄。
安全:僅供研究用。不得用于人體或藥用。請閱讀安全數據表(SDS)了解所有相關化學品。標記試劑涉及的任何操作,都應配備使用適當的個人安全保護裝置 - 眼鏡、耐化學性手套(如 腈類手套),以及在實驗室通風柜進行操作。
試劑盒組成
每個標記試劑盒包括1瓶以下試劑:
Cat. # Item Quantity
LT-2AB-01 2-AB染料 (2-氨基苯甲酰胺) 5 mg
LT-DMSO-01 二甲基亞砜 DMSO 350 μl
LT-ACETIC-01 冰醋酸 500 μL
LT-CYANOB-01 氰基硼氫化鈉(還原劑) 6 mg
所需的其他試劑和設備
  • 加熱模塊、爐或相近功能的干熱器(不能使用水浴),設定在65°C
  • 旋轉蒸發儀(例如Savant, Heto, 或其它)
  • 反應小瓶 (e.g. 聚丙烯 微量離心瓶)
  • 注:如果進行樣品標記后洗滌(參見樣品洗滌部分),則需要其它試劑。
標記操作時間線
LudgerTag 標記過程,加上可選樣品標記后洗滌,通常需要4-5個小時:
過程 時間 總時間(小時)
樣品轉移到反應瓶并干燥 30分鐘 0.5
配置并加入標記試劑 15分鐘 0.75
樣品和試劑一起培養 3 小時 3.75
標記后洗滌 1小時 4.75
還原性胺化
標記反應涉及一個兩步反應過程。 (見圖1):
1.希夫堿生成
具有未結合還原末端的多糖,其末端在閉環(有環)和開環(無環)狀態之間處于平衡狀態。染料的伯胺對無環還原端基殘基的羰基碳進行親核進攻,形成部分穩定的席夫堿。
2. 希夫堿還原
希夫堿亞胺基通過化學還原生成穩定標記的多糖。
2-AB標記多糖反應機理
圖1:通過還原性胺化反應,用2-氨基苯甲酰胺標記多糖
標記操作概述
LudgerTag 多糖標記試劑盒,用于熒光或發色標記帶有為結合還原端基的多糖。在所中色譜和結構序列分析中,經標記的多糖既可以進行高靈敏度熒光檢測,也可以進行紫外吸收監測,包括使用LudgerSep液相色譜柱的色譜分析和使用外切糖苷酶的序列分析(參見 參考1-5, 7)。
標記過程概述如下:
1 多糖準備
準備多糖樣品,去除類似鹽和洗滌劑等可能干擾標記過程的污染物。
2 多糖干燥
將樣品置于反應小瓶中干燥。
3 標記試劑準備
將試劑盒中相關試劑混合制備新鮮的染料標記溶液。
4 將標記試劑加入多糖中
將小量的標記溶液加入每一份多糖樣品中
5 培養
培養樣品使標記反應進行下去。
6 標記后洗滌
培養完成后,如有必要(根據后續分析過程而定),直接進入洗滌流程以去除過量的標記試劑。.
7 經標記的多糖儲存或者分析
經標記的多糖樣品現在可以用于分析了。
樣品準備
要進行標記的多糖樣品,無論是純化的或是多糖混合物,必須包含未結合的還原端基,顆粒狀且不含無機鹽,并溶于易揮發的溶劑體系中(最好是純水)。
下列物質可能干擾標記反應,必須在進行LudgerTag™ 標記之前,事先從多糖樣品中去除:
不揮發溶劑
不揮發鹽,尤其是過渡金屬離子
洗滌劑
染料和染色劑,例如考馬斯藍
Ludger提供了一系列LudgerClean™試劑盒,用于在Ludgertag™標記之前洗滌多糖樣品。這些內容在LudgerClean多糖洗滌指南[參考6]中有詳細說明。
標準樣品制備概述如下:
1 多糖純化
如有必要,從樣品中按照多糖洗滌指南[參考6]中所述去除非碳水化合物污染物。
2 將樣品轉移至反應小瓶中
從典型糖蛋白中獲得的多糖,樣品量應在100個皮摩爾-50納米摩爾的范圍內。單一的純多糖,即使僅有5皮摩爾的量,也可以被標記,并在之后高效液相色譜分析中檢測出。適用的反應小瓶,包括小型聚丙烯微離心管和可用于PCR操作的試管。
3 樣品干燥
理論上,應使用旋轉蒸發器干燥樣品。如果條件不允許,可以小心使用冷凍干燥(尤其要確保在小瓶的最底部的樣品,凍干成小而致密的物質)。 不要將樣品置于高溫(>28℃)或極端pH環境下,因為這樣會導致唾液酸在酸催化下耗損(高溫、強酸),或多糖還原端的異構反應(強堿)。
標記試劑準備
按如下過程制備新鮮標記試劑:
4 制備DMSO-醋酸混合液
150μl冰醋酸加入盛有DMSO的小瓶中,并用移液器抽吸混合。
冰醋酸和DMSO的貨號分別為LT-ACETIC-01和 LT-DMSO-01。
小心敲擊安瓿瓶以震落附著安瓿上半部的內容物,然后小心打開安瓿瓶。
如果DMSO凍成固體,在烘箱或加熱快上在30-65℃之間緩慢加熱小瓶(在啟封前)。
5 加入染料
將100μl DMSO-醋酸混合液加入LudgerTag™ 2-AB (2-氨基苯甲酰胺) 染料小瓶中,混合直至染料完全溶解。
染料貨號為LT-2AB-01。
6 加入還原劑
將溶解的染料加入盛有LudgerTag™ 氰基硼氫化鈉 (還原劑) 的小瓶中,使用移液器抽吸混合直至還原劑完全溶解形成最終的標記試劑。
氰基硼氫化鈉還原劑的貨號是LT-CYANOB-01。
如果還原劑難以溶解,那么在65℃的恒溫培養箱中,或者加熱塊上,輕緩地加熱至多4分鐘。如還原劑仍未全溶,補加10μl純水并混合均勻。
標記試劑應防潮,并在配置60分鐘內使用。
標記反應
7 將標記試劑加入樣品
將5μl標記試劑加入到每一份經干燥的多糖樣品中,蓋上離心管,徹底混合,然后輕輕敲擊以確保標記溶液位于小瓶的底部。
8 培養
將反應小瓶放在65℃的加熱塊、砂浴或烘箱中,培養3小時。
培養必須在干燥的環境下進行。請使用培養箱或干燥塊,請務必不要使用水浴。
樣品必須完全溶解在標記溶液中,才能有效進行標記。為了促進完全溶解,樣品可在培養溫度達到65℃后渦旋混合30分鐘,然后繼續培養。
在大多數情況下,培養時間可以縮短至2小時或延長至4小時,而不會顯著改變標記反應結果。
9 離心并冷卻
培養結束后取出樣品,短暫離心微量試管,并讓其完全冷卻至室溫。
LudgerClean™ S 標記后樣品洗滌
對于特定的應用 - 例如后續的HPLC分析,標記后的樣品洗滌(去除多余的染料和其它標記試劑) 是必不可少的。使用LudgerClean™ S 小柱 (貨號 LC-S-Ax, 此處x代表試劑盒中小柱的數量)按試劑盒所附標準操作程序可以完成樣品洗滌。
對于過量標記試劑不會影響后續樣品分析的應用而言,樣品標記后洗滌并非必需。這些分析手段包括碳水化合物電泳,游離染料會從標記多糖條帶處分離開。
LudgerTag™ 2AA標記多糖的分析
LudgerTag™ 2-AB標記多糖可通過一系列分析方法進行研究,包括HPLC,凝膠電泳和質譜。 這些會在參考資料8里詳細敘述,在下文也有概述。
高壓液相色譜分析
LudgerTag™ 2-AB標記多糖混合物可以通過一系列HPLC(高壓液相色譜)方法進行分離和分析,也包括LudgerSep HPLC:

分析類型

柱子

貨號

帶電荷和中性多糖的分離

LudgerSep™ C

LS-C-01

帶電荷和中性多糖的剖面分析

LudgerSep™ N

LS-N-01

中性多糖的分離

LudgerSep™ R

LS-R-01

上述多糖分析柱的使用在參考4和參考8里有概述。
對于從復雜多糖混合物中純化和分析LudgerTag?標記寡糖而言,LudgerSep? N柱是非常有效的分析工具。
關于您的特殊應用,請聯系我們獲取建議。
酶法分析
高純度,測序級酶(例如外切糖苷酶),適合N-和O-鏈接LudgerTag™ 標記多糖的結構分析,許多公司有市售產品。
選擇糖苷酶時,尤其應注意選擇配方與您專屬應用匹配的產品。例如,部分酶和緩沖液擁有會干擾特定分析手段的組份。在選則您工作所需的酶和反應條件時,請致電我們獲取指導。
質譜和電泳
LudgerTag™ 標記多糖也可以用質譜、電泳和其它光譜分析手段進行分析。如果您想確定最合適的分析條件,請來電咨詢。
參考文獻及相關文獻
1 Bigge, J.C.; Patel, T.P; Bruce, J.A.; Goulding, P.N.; Charles, S.M; Parekh, R.B. (1995) 'Non-selective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranilic acid'. Analytical Biochemistry 230: 229-238
2 Guile, G.R.; Rudd, P.M.; Wing, D.R.; Prime, S.B.; Dwek, R.A. (1996) 'A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles'. Analytical Biochemistry 240: 210-226
3 Townsend, R.R.; Lipniunas, P.H.; Bigge, C.; Ventom, A.; Parekh, R. (1996) 'Multimode high-performance liquid chromatography of fluorescently labeled oligosaccharides from glycoproteins'.Analytical Biochemistry 239: 200-207
4 LudgerSep High Resolution HPLC Carbohydrate Profiling Guide (Cat # LS-GUIDE-01)
5 Ludger Enzyme Selection Guide (Cat # EZ-GUIDE-01)
6 LudgerClean Glycan Cleanup Guide (Cat # LC-GUIDE-01)
7 Hardy, M.R. (1997)‘Glycan labeling with the fluorophores 2-aminobenzamide and anthranilic acid’in ‘Techniques in Glycobiology’, edited by Townsend, R.R and Hotchkiss, A.T.. Marcel Dekker Inc, New York .
8 Ludger Technical Note # TN-AB-01: Analysis of 2-AB (2-aminobenzamide) labeled glycans
故障排除
Ludgertag?標記過程是一種高效、可靠的方法。如果出現問題,通常可以毫無毫不費力地予以糾正。以下是最有可能出現的問題、可能的原因和解決方案。
染料結合率低 / 標記收率低
標記溫度不正確
請確保烘箱或加熱塊預設與培養溫度相稱,并確保反應管在標記時始終處于該溫度下。
樣品未完全溶解
多糖必須完全溶解在標記混合溶液中,標記效率才能最大化。
請確保在培養操作之前,樣品與標記試劑完全混合均勻。作為預防措施,在培養開始后,繼續仔細攪拌樣品15分鐘。
樣品中含有干擾標記的污染物。
在標記之前,請確認多糖得到充分純化(參見操作步驟1和 LudgerClean? 多糖洗滌指南)
標記溶液無效。
請務必在使用前即刻配置標記溶液 - 試劑在混合后的幾小時內即會失活。
啟動時多糖較原先預估的要少
多糖不含未結合的還原基團。
2-AB染料通過未結合的還原端的醛基與多糖結合。糖醇和還原端基已經結合的多糖 (例如糖肽,糖脂和已標記多糖)不含未結合還原端基,因此無法和染料結合。
在標記后洗滌時多糖損耗。
請確認已經按照洗滌規程去除多余標記試劑,且洗滌試劑正確配制。
標記樣品中含有帶熒光的非碳水化合物
原始的多糖中含有醛穩定污染物。
請確認多糖在標記前已經充分純化(參見操作步驟1和LudgerClean多糖洗滌指南)。
標記后洗滌步驟未正常工作
請確認已經按照洗滌規程去除多余標記試劑,且洗滌試劑正確配制。
較小分子量多糖選擇性損耗
洗滌小柱未正確填充
請確保小柱已經正確充填,樣品上盤時,柱床已經用乙腈浸潤。
標記后洗滌時是否使用了不當清洗劑。
請確保清洗劑正確配制。
較大分子量多糖選擇性損耗
樣品未完全溶解
多糖必須完全溶解于標記混合物中以獲得最大標記效率。 較大的多糖較小分子糖更難溶于標記混合物中。請確保樣品在培養前與標記試劑充分混合,可以在培養開始后再小心混合樣品15分鐘,以作為預防措施。
多糖去唾液酸化
樣品在高溫下水溶液中呈酸性。
避免唾液酸化多糖樣品溶液長時間處于酸性和高溫環境下。注意還原胺化反應是在無水條件下進行的,在此條件下唾液酸的損失最小。
通常,樣品保存在5-8.5的溶液中,避免暴露在30℃以上的溫度下。樣品溶于pH緩沖溶液(pH介于5和8.5之間),即使在高于30℃的溫度下,也往往能夠抵抗酸催化的去唾液酸反應。即使這樣,也要謹慎行事,盡可能保持樣品冷卻。
樣品標記后沒有正確洗滌
確保樣品在還原胺化反應后立即進行標記后洗滌,且標記后的干燥和洗滌應金肯能快地進行。
未經干燥和隨后洗滌的標記樣品容易發生酸催化去唾液酸反應。
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